羊水細(xì)胞(amniotic cell)是羊水中胎兒脫落細(xì)胞的總稱，可分為上皮樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、羊水樣細(xì)胞。羊水細(xì)胞主要用于胎兒染色體疾病和先天性代謝疾病的產(chǎn)前診斷。

一、材料與試劑

1．培養(yǎng)液 PRMI 1640、HamF10、HamF、12等培養(yǎng)液均可。一般添加20%胎牛血清或30％小牛血清，谷氨酰胺1mmol／L，青霉素50U／ml，鏈霉素50μg／ml。

2．分層液 比重為1．077g／ml的Ficoll一Urografin溶液。

3．清洗液1：1混合的培養(yǎng)基與胎牛血清。

4．消化液0．25％胰酶一0．1％EDTA混合消化液。

二、操作方法

(一)取材

1．采用羊膜腔穿刺術(shù)，妊娠12～30周的羊水細(xì)胞均可培養(yǎng)成功。一般在孕16～20周時(shí)，子宮已超出盆腔，易穿刺取得羊水而且羊水中活細(xì)胞比例高，是羊膜腔穿刺行羊水細(xì)胞培養(yǎng)的*時(shí)期。

2．B超定位后，常規(guī)消毒，采用22號(hào)PIE穿刺針，經(jīng)腹壁行羊膜穿刺術(shù)抽取羊水。zui初抽取約2ml羊水棄去，更換注射器后繼續(xù)抽取羊水約15～40ml。留2ml羊水用于計(jì)數(shù)細(xì)胞(活細(xì)胞及血細(xì)胞計(jì)數(shù))。其余羊水注入離心管中，備用。

(二)羊水細(xì)胞的富集

1．將注入離心管的羊水，以800r／min離心10min，棄上清液。

2．加入5ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，制成細(xì)胞懸液。

3．將4ml分層液加入一個(gè)新的離心管中，再將細(xì)胞懸液輕鋪于分層液表面，形成清晰液面。

4．經(jīng)450r／min離心20min后，離心管中液體分三層，收集第三層，棄上面兩層液體和細(xì)胞沉淀。

5．向收集到的細(xì)胞懸液中加清洗液清洗，1500r／min。離心7min，棄上清液。重復(fù)清洗1次。

6．用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)。

(三)培養(yǎng)方法

1．以1×105個(gè)／m1的活細(xì)胞密度接種，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．培養(yǎng)5d后，若觀察到有較好的梭形細(xì)胞克隆則更換新鮮培養(yǎng)液。以后每隔2d換一次液。

3．當(dāng)培養(yǎng)瓶中長出幾個(gè)孤立的細(xì)胞克隆時(shí)，棄培養(yǎng)液，用PBS洗，再加少量O．25％胰酶一O．1％EDTA消化液，消化5～10min。

4．加入培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，用吸管吹打細(xì)胞使之集落分散。

5．分散的細(xì)胞仍可保留在原培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后即可換液。以后每2d換液一次，并逐日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

三、注意事項(xiàng)

1．在準(zhǔn)備接種用的細(xì)胞懸液時(shí)，保留一定量的羊水，以保持體內(nèi)生長條件，利于羊水細(xì)胞的培養(yǎng)。

2．在體外培養(yǎng)時(shí)，羊水細(xì)胞不易貼壁，所以在培養(yǎng)的前幾天要靜置培養(yǎng)。

3．*次換液時(shí)，如果細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可以全量換液；若細(xì)胞狀態(tài)不好，半量換液為宜。